3.3 结果与讨论

　　3.3.1 大孔树脂分离纯化实验结果与讨论

　　3.3.1.1 大孔树脂的筛选

　　不同大孔树脂对枸杞果总黄酮静态吸附考察，采用静态吸附量和解析率选择树脂。不同大孔吸附树脂在分离植物有效成分时利用吸附的可逆性，由于树脂极性不同，孔容等理化指标不同，解吸的难易也不同，所以解析率是筛选树脂的重要因素。若树脂的静态吸附量大，则分离效果好;但若吸附过强，则造成洗脱困难，产品回收率低。因此对于树脂的选择，应从吸附量和解吸率两方面综合考虑。表3.1为5种大孔吸附树脂对枸杞果中总黄酮的静态吸附及解吸性能结果。

　　不同树脂纯化枸杞果黄酮效果比较

树脂型号	聚酰胺	ADS-7	D1300	HPD-100	HPD-400
吸附率∕﹪	71.34	67.93	68.00	74.49	61.96
解析率∕﹪	66.79	68.05	55.23	78.42	77.20

　　表3.1 不同树脂纯化枸杞果黄酮效果

　　HPD-100树脂，吸附量和解吸率都最高，因此选用HPD-100树脂纯化枸杞果总黄酮。

 

3.3.1.2 静态吸附动力学特性测定

　　合适的大孔树脂除了应具有较强的吸附性能与良好的解吸效果外，亦应具有较快的吸附速率。HPD-100有较高的吸附量和解析率，因此选择HPD-100进行静态吸附动力学曲线。对HPD-100大孔树脂的静态吸附动力学进行了研究，结果如图3.1所示。HPD-100树脂对枸杞果总黄酮的吸附为快速平衡型，即在起始阶段吸附量比较大，在5小时内基本接近达到平衡。HPD-100树脂对枸杞叶总黄酮具有良好的静态吸附动力学特性，较适宜枸杞果总黄酮纯化。

HPD-100大孔树脂静态吸附曲线

　　图3.1 HPD-100大孔树脂静态吸附曲线

　　由图3.1可知，静态条件下HPD-100大孔吸附树脂对枸杞黄酮的吸附在5h达到平衡。

　　95%的乙醇对HPD-100大孔树脂的静态解析曲线。

　　图3.2 95%的乙醇对HPD-100大孔树脂的静态解析曲线

　　由图3.2可知，95%的乙醇对HPD-100树脂上枸杞黄酮的解析速度很快，在90 min时基本达到平衡。

　　3.3.1.3 纯化工艺的确定

　　综合以上实验结果，确定枸杞总黄酮纯化工艺条件：树脂预处理→按照1:25的料液比往锥形瓶中加入树脂和粗提液→28℃恒温空气摇床震荡吸附5h摇床频率150 r/min→过滤树脂粗提液混合液并用去离子水将树脂冲洗2-3遍至冲洗液无色→按照1:25的料液比往锥形瓶中加入吸附了枸杞黄酮的树脂和95%的乙醇→28℃很稳空气摇床解析100min摇床频率150 r/min→过滤，取解析液→解析液用旋蒸仪在45℃旋转频率120 r/min的条件下旋转蒸发至原体积的1/50→在45℃条件下枸杞黄酮浓缩液用烘箱烘干成黄酮固体化合物待用。

　　3.3.1.4 HPD-100大孔吸附树脂纯化枸杞总黄酮的工艺验证结果

　　按上述纯化工艺，通过HPD-100大孔吸附树脂对枸杞叶总黄酮分离纯化，进行重复试验，结果见表3.2。

次数	吸附率（%）	解析率（%）
1	74.49	78.42
2	74.42	78.30
3	73.98	78.52
均值	74.29	78.41
标准偏差	0.27	0.11
相对标准偏差	0.37%	0.14%

　　表3.2 HPD-100大孔吸附树脂对枸杞叶总黄酮分离纯化

　　从表中结果可知，重复实验的枸杞总黄酮纯化吸附率与解析率的相对标准偏差(RSD)分别为0.37%，0.14%，说明工艺重复性较好，较稳定，可用于枸杞总黄酮的分离与纯化。

　　3.3.15 HPLC测定枸杞果和根皮黄酮主要成分

　　图A

　　图B

　　图C

　　1.绿原酸;2. 芦丁;3. 槲皮素;4.异鼠李素;5. 山奈酚;6.杨梅酮

　　黄酮混合标准品(A)、枸杞黄酮微生物提法样品(B)、枸杞根皮黄酮微生物提法样品(C)

　　在3.2.2.2节色谱条件下，标准样品及枸杞黄酮样品可以得到分离度较好的HPLC谱图(图A.B.C)。图A中6种标准品绿原酸、芦丁、槲皮素、异鼠李素、山奈酚和杨梅酮的出峰时间分别为3.35，4.53，5.32，6.17，7.67，min和11.77min。

　　图B为微生物提法枸杞果黄酮物质的HPLC谱图，对照图A可知其中含有，绿原酸、芦丁和异鼠李素。

　　图C为微生物提法枸杞根皮黄酮物质的HPLC谱图，对照图A可知其中含绿原酸、芦丁和槲皮素。

　　3.4 小结

　　大孔吸附树脂分离纯化黄酮类化合物的研究中，研究学者比较了研究学者比较了聚酰胺、ADS-7、D1300、HPD-100、HPD-400五种树脂对吸附性能，和解析性能。结果HPD-100大孔树脂对枸杞黄酮类化合物吸附率和解析率较高，分离度好，解吸容易，更适合黄酮类化合物的分离。

　　通过高效液相色谱法(HPLC)同时检测枸杞黄酮提取物中可能含有的的六种黄酮成分。本方法简便快捷，结果准确可靠，重复性好，灵敏度高。枸杞黄酮的分离程度较好。并在枸杞果黄酮中检测出了绿原酸、芦丁和异鼠李素，枸杞根皮黄酮中检测出了绿原酸、芦丁和槲皮素。

　　第四章 抗氧化活性分析

　　4.1 材料和仪器

4.1.1

材料和试剂

　　枸杞黄酮样品2.2.1方法制得，并通过HPD-100大孔树脂优化后的工艺进行纯化。

　　DPPH分析纯，无水乙醇分析纯上海化学试剂有限公司。

　　4.1.2 仪器

　　UV-765 型紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司;电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司;电子天平：普利赛斯国际贸易(上海)有限公司。

　　4.2 实验方法

　　DPPH溶液(2×10-4mol/L)的配制：精确称取DPPH20mg，用无水乙醇溶液溶解并定容至250mL。

　　测定方法[36]：2mL取待测液及2mL 2×10-4mol/L DPPH·加入同一具塞试管中，摇匀;0.5小时后用无水乙醇作参比，测定其吸光度A0，同时测定2mL无水乙醇与2mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液混合液的吸光度A1，以及2mL待测液与2mL无水乙醇混合液的吸光度A2，计算测定液对DPPH·的抑制率：

　　抑制率=[1-(A0-A2)/A1]×100%

　　A1：未加测定液时DPPH·的吸光度;A2：测定液在测定波长吸光度;

　　A0：加测定液后DPPH·的吸光度。

　　4.3 数据分析

　　所有数据采用Excel 2003计算机软件进行统计处理。

　　4.4 结果与讨论

　　4.4.1 枸杞果黄酮DPPH抗氧化活性

　　4.4.1.1 微生物法提取枸杞黄酮DPPH抗氧化活性

　　图4.1 微生物法提取枸杞黄酮DPPH抗氧化活性

　　由图4.1可知IC50为原液稀释85倍时的质量浓度，代入标曲计算此浓度为0.003815mg/ml。

 

4.4.1.2乙醇法提取枸杞黄酮DPPH抗氧化活性

　　图4.2 乙醇法提取枸杞黄酮DPPH抗氧化活性

　　由图4.2可知IC50为原液稀释80倍时的质量浓度，代入标曲计算此浓度为0.004107mg/ml。

　　4.4.2 枸杞根皮黄酮DPPH抗氧化活性

　　4.4.2.1 微生物法提取枸杞根皮黄酮DPPH抗氧化活性

　　图4.3 微生物法提取枸杞根皮黄酮DPPH抗氧化活性

　　由图4.3可知IC50为原液稀释80倍时的质量浓度，代入标曲计算此浓度为0.0125mg/ml。

　　4.4.2.2 乙醇提取法枸杞根皮黄酮DPPH抗氧化活性

　　图4.4乙醇提取法枸杞根皮黄酮DPPH抗氧化活性

　　由图4.4可知IC50为原液稀释100倍时的质量浓度，代入标曲计算此浓度为0.01665mg/ml。

　　4.4 小结：

　　IC50(自由基被半数消除时所加入的抗氧化剂的浓度)越低则表示其抗氧化活性越高。

　　从以上数据及图表，微生物提取法提取的枸杞(枸杞果和枸杞根皮)黄酮的抗氧化性较乙醇提取法提取的枸杞(枸杞果和枸杞根皮)黄酮的抗氧化性高，综合考虑到微生物提取法较乙醇提取法更环保节能，工艺更简单，有效成分活性更高等因素，本人认为微生物提取法提取枸杞黄酮(枸杞果和枸杞根皮)在当代新兴环保的科技，特别是化妆品工业中趋势中占有一定的优势，值得深入的研究并加以推广。

　　第五章 结论与建议

　　5.1 结论

　　本文通过微生物提取法和乙醇提取法对枸杞中的黄酮类化合物进行提取。同时对枸杞叶黄酮粗提物进行大孔树脂纯化，并通过高效液相色谱对其成分进行测定分析。此外还进行了枸杞叶黄酮的DPPH自由基清除率测定实验，进而探究了微生物法提取的枸杞黄酮的抗氧化功效。研究结果表明：

　　1.微生物法枸杞黄酮提取工艺研究

　　通过研究五种酵母菌对枸杞黄酮提取率的影响可知不同的酵母菌对枸杞黄酮的提取率虽然有影响但是差别并不是很大，这可能和菌的种属性有关。总体来说2号菌对枸杞果黄酮和枸杞根皮黄酮的提取率较高，提取率分别为提取率分别为0.649%和8.235%。

　　2.枸杞黄酮分离纯化研究

　　选用 5种大孔吸附树脂对枸杞枸杞叶黄酮的提纯作比较试验，采用紫外-可见分光光度法，以不同大孔树脂对枸杞叶黄酮的吸附率、解吸率为评价指标，通过考察树脂类型、绘制树脂静态，综合评判确定最优工艺，并选取HPD-100吸附树脂做枸杞黄酮提纯应用试验。通过采用HPD-100大孔树脂吸附对枸杞黄酮水溶液进行吸附5小时，以95%乙醇进行解析2小时，简单纯化后得到枸杞黄酮提取物。

　　应用高效液相色谱法对初步纯化的枸杞黄酮进行分离与测定，色谱条件：Spherisorb C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm， 5μm);检测波长368nm,流动相：甲醇-水(60∶40)，流速为1.0 mL/min;进样量为10μL。测得枸杞果提取物中含有绿原酸、芦丁和异鼠李素;枸杞根皮提取物中含有绿原酸、芦丁和槲皮素。

　　3.枸杞黄酮的抗氧化活性研究

　　通过DPPH·的清除能力试验测定枸杞叶黄酮的抗氧化活性。研究表明：微生物提取法提取的枸杞果黄酮的IC50为 0.003815mg/ml，枸杞根皮黄酮的IC50为0.0125mg/ml乙醇提取法提取的枸杞果黄酮的IC50为0.01665mg/ml，枸杞根皮黄酮的IC50为0.004107mg/ml。结合2.3的实验结果可知微生物提取法对枸杞果黄酮、枸杞根皮黄酮的提取率分别为0.65%、8.325%都较乙醇提取法的提取率0.67%、9.55%低，但微生物提取法提取的枸杞果、根皮黄酮对DPPH自由基的清除能力均略高于乙醇提取法提取的枸杞果、根皮黄酮，微生物提取法在新型环保趋势下占有一定优势。

　　5.2 建议

　　1. 枸杞黄酮乙醇提取法提取时间短，效率较高，但耗能较大;微生物提取法条件较温和且符合现代环保理念，但提取时间较长，提取率较低，且对环境的要求严格。从实验到工业生产过程需要结合实际情况与具体需求，寻求一种合理、快捷和高效的提取方法。

　　2. 采用高效液相色谱法对枸杞黄酮进行分离检测，各类黄酮的性质有所差异，导致色谱方法的差异， 要精确的分离测定枸杞中的黄酮类物质，还需作进一步的色谱条件优化。3. 黄酮类化合物对自由基的清除以及抑制作用对我们进一步探讨枸杞黄酮抑制衰老机体炎症作用、抗氧化美白机理有着十分重要的借鉴意义，今后的研究可从枸杞黄酮类化合物有效成分单体的分离以及阐明其抗炎药效机理两个方面进行。今后的研究可着重于丰富枸杞的生物药用功能和作为化妆品功效成分的可行性，提高其社会经济价值。