第3章 试验结果与讨论

　　3.1 双乙酸钠对指状青霉菌丝体生长的影响

　　双乙酸钠对于指状青霉菌丝体生长影响的初步判断如图1所示，用0.5%(w/w)浓度的双乙酸钠处理的指状青霉菌丝体生长直径略大于6.0 mm，基本没有生长。说明该浓度的双乙酸钠对指状青霉菌丝体有抑制作用，可以设计0.1%至0.4%(w/w)四种浓度梯度的实验做继续研究。

　　图1抑菌圈的初步判断

　　研究数据由图2可知，随着添加量的增加，双乙酸钠对指状青霉的抑制作用是在逐渐加强的，培养2 d后，当双乙酸钠的添加浓度为4 mg/mL时，肉眼看不到任何菌丝体生长的痕迹，则双乙酸钠对指状青霉的最小抑菌浓度MIC为4 mg/mL，新的菌苔再培养2 d后，即第4 d，当双乙酸钠的添加浓度为4 mg/mL时，以肉眼看不到任何菌丝体生长的痕迹，菌斑直径仍6 mm，则双乙酸钠对指状青霉的最小杀菌浓度MFC为4 mg/mL。

　　图2双乙酸钠对指状青霉菌丝体的生长影响抑菌圈的细致判断

　　3.2双乙酸钠对指状青霉细胞膜通透性的影响

　　细胞膜通透性异常增加是细胞损伤的早期表现，细胞膜在维持细胞生命活动所需内含物(如糖类、蛋白质、无机盐等)含量上发挥重要作用，细胞膜损伤能导致细胞内含物的泄漏[22]。双乙酸钠对指状青霉菌丝细胞外电导率影响的变化结果，如图3所示，在处理时间为0 min和30 min的组分，对照组的胞外电导率(单位:mS/cm)，从10.47迅速升到14.11，而处理时间为60 min的组分，对照组的胞外电导率有小幅度的上升趋势，从14.11到14.15，处理时间为90 min的组分，胞外电导率值又急剧下降为13.41，而处理时间到达120 min的组分，胞外电导率值又上升到14.16，如不考虑处理90 min时的菌丝体胞外电导率数值，总体趋势呈上升状态。

　　而用4 mg/mL浓度的双乙酸钠处理的组分，处理时间为0 min和30min的组分，胞外电导率值从12.35迅速上升到14.65，而处理时间到达90min的组分，胞外电导率值又从14.65缓慢下降到14.52，而处理时间到达120 min的组分，胞外电导率值迅速上升到15.30，总体亦呈上升趋势，且处理组的胞外电导率数值均高于对照组，即加入双乙酸钠，指状青霉的菌丝体胞外电导率明显升高。说明随着时间的变化，细胞内的钾离子、钠离子等影响细胞内酶的合成及维持细胞膜两边的渗透压的重要离子开始外泄，细胞膜通透性变大，对指状青霉菌丝体细胞内膜功能和细胞功能有一定影响。

　　图3双乙酸钠对指状青霉胞外电导率的影响

　　3.3双乙酸钠对指状青霉细胞胞外pH的影响

　　双乙酸钠对指状青霉菌丝细胞外pH值影响的变化结果，如图4所示，处理时间为0 min到60 min的组分，对照组的胞外pH值是缓慢上升的从6.71到6.78，而处理时间到达90 min的组分，对照组的胞外pH又下降到低于初始值的6.02，处理时间为120 min的组分，对照组的胞外pH数值又上升到6.69，除了处理90 min的菌丝体胞外pH数值骤然减少，其他组分的数值变化不明显;而用4 mg/mL浓度的双乙酸钠处理的组分，处理时间为 0 min到120 mi的所有组分，其胞外pH值一直在缓慢的波动，变化如下，从开始的4.56略降低到4.53，又少许上升至4.55，处理时间到达90 min时，得到唯一变化较大的数值4.48，最后有上升为4.57，除了处理90 min的菌丝体的胞外pH数值相对减少之外，其他组分的数值亦无显著变化，说明指状青霉菌丝体细胞的胞外pH值与用双乙酸钠处理的时间长短无特别大的关联。

　　但其数值又明显低于对照组分，即加入双乙酸钠，指状青霉的菌丝体胞外pH明显降低。胞外pH值的降低意味着胞内pH值的上升，细胞内的H+减少 [23]，在理论上此变化也可能会对指状青霉菌丝体细胞膜功能产生些许影响。但是考虑到双乙酸钠的水溶液呈酸性，经过测量，1 mg/mL，2 mg/mL，3mg/mL，4 mg/mL的双乙酸钠溶液及用0.9%(w/w)的生理盐水配置的0.4%(w/w)的双乙酸钠溶液的pH分别为：4.18、4.20、4.25、4.19、3.61，不排除是双乙酸钠离子的干扰导致。

　　图4双乙酸钠对指状青霉胞外pH值的影响

　　3.4双乙酸钠对指状青霉菌丝体细胞成分释放的影响

　　双乙酸钠对指状青霉菌丝体260 nm处细胞成分释放影响的变化结果，如图5所示，对照组和处理组在260 nm处的吸光度值均随着处理时间的增长而增加，对照组从处理时间为0 min 到60 min的三组菌丝体，在紫外分光光度计260 nm 处的吸光度数值几乎均匀增加，每次约增加0.06，而处理时间为120 min的组分，其对照组吸光度迅速从0.335增加为0.475。

处理组数值的变化趋势与对照组类似，但吸光度增加的更快，处理时间为0 min到30min的组分，就从初始值0.217增加至0.318，处理时间达到60 min的组分，吸光度增加相对变慢，只增加到0.376，而处理时间为120 min的组分，其相邻两组份之间的吸光度增加量为最大，数值达到0.711。随着处理时间增长，对照组的吸光度值愈加显著低于处理组，即加入双乙酸钠，指状青霉菌丝体260 nm处的吸光度值开始变大，说明随着双乙酸钠处理时间的延长，指状青霉菌丝体胞内核酸大量外泄，胞浆膜和细胞膜的通透性愈加变大，甚至已经受到不同程度的损伤，对指状青霉菌丝体细胞成分释放有

　　一定影响。

　　图5双乙酸钠的指状青霉260 nm细胞成分释放的影响

　　3.5双乙酸钠对指状青霉菌丝体脂质含量的影响

　　胆固醇标准曲线如图6所示，经过计算得到相关系数R2=0.9966>0.99，说明具有可行度和线性关系，可以用于定量分析[20]。

　　6胆固醇标准曲线

　　双乙酸钠对指状青霉菌丝菌丝体脂质含量影响的变化结果，如图3-7所示，前期处理时间为0、30 min、60 min组分的菌丝体，在紫外分光光度计的520 nm波长处的吸光度值从0.232减小到0.208再减小到0.184，减少量非常均匀，而前期处理时间为120 min组分的菌丝体在紫外分光光度计的520 nm波长处的吸光度值，又增加到0.205。

　　而用4 mg/mL浓度的双乙酸钠处理的组分，变化趋势与对照组类似，前期处理时间为0 min、30 min、60 min的三组菌丝体，在紫外分光光度计的520 nm波长处的吸光度值从0.191减小到0.166再减小到0.144，减少值随药物处理时间的增加而增大，前期处理时间为120 min组分的菌丝体在紫外分光光度计的520 nm波长处的吸光度值，同样是增加的，增加到0.188，处理组的每组数值又明显低于对照组分，即加入双乙酸钠，指状青霉的菌丝体细胞总脂质含量相比对照组减少。脂质作为细胞膜的主要成分，说明双乙酸钠对指状青霉菌丝体的细胞膜结构造成一定程度的损伤，一方面可以破坏其细胞，致其衰亡，另一方面，也使一些能够抑制菌体活性的组分可以更加容易的通过其膜结构，达到细胞内部作用。

　　3-7双乙酸钠对指状青霉菌丝体脂质含量的影响

　　第4章 总结与展望

　　4.1 总结

　　本论文主要研究不同浓度的双乙酸钠对指状青霉菌丝体生长的影响及其抑菌作用，实验前期，主要是测量抑菌圈直径，判断双乙酸钠是否会对指状青霉菌丝体生长产生抑制作用。确定出双乙酸钠的MIC和MFC，开始研究其对指状青霉菌丝体的核算泄露、胞外电导率、胞外pH、脂质含量等方面的指标值的影响。

　　实验结果表明，双乙酸钠可以抑制柑橘采后指状青霉菌丝体的生长，其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)均为0.4%(w/w)即4 mg/mL。用此浓度的双乙酸钠处理指状青霉，测量双乙酸钠对指状青霉菌丝体影响的核酸泄露、胞外电导率、胞外pH、脂质含量等方面的指标值，进行数据处理，与对照组相比较，指状青霉的菌丝体胞外电导率和OD260 nm数值变大，而胞外pH和OD520 nm数值则变小。

　　胞外电导率的增加与胞内K+、Mg2+、Ca2+等外泄有关[23-25]，而实验中处理组的值，在0 min到30 min期间呈上升趋势且最为显著，30 min到120 min有上升趋势但较缓慢，说明随着时间的变化，细胞膜通透性发生了一定程度的变化，对指状青霉菌丝体细胞内膜功能和细胞功能有一定影响。

　　胞外pH值的降低意味着胞内pH值的上升，细胞内的H+减少 [23]，在理论上此变化也可能会对指状青霉菌丝体细胞膜功能产生些许影响。但是考虑到双乙酸钠的水溶液呈酸性，不排除是双乙酸钠离子的干扰导致。

　　4.2260 nm是细胞内成分核酸的特征波长，OD260 nm值的显著增大表明指状青霉胞内的核酸大量泄漏而胞内物质的泄漏代表着细胞质中胞浆膜和细胞膜发生严重和不可逆的损害[26-28]。而实验中处理组的值从30 min开始，一直高于对照组且呈上升趋势。表明指状青霉胞内核酸等物质泄漏量逐渐增多，暗示着细胞内的遗传过程受到影响[17,29-30]。

　　脂质占细胞干质量的60%～80%，是细胞膜的结构物质[19]，实验中前期不同时间处理的处理组的脂质含量都低于对照组，说明指状青霉菌丝体细胞膜的组成结构发生变化，细胞膜上的重要成分脂质逐渐流失，说明双乙酸钠会损伤指状青霉菌丝体的细胞膜，并将完整的细胞膜结构破坏，对其细胞膜的通透性及其细胞的活性产生了潜在的伤害。

　　综上所述，双乙酸钠对柑橘采后绿霉的生长有一定抑制作用。

　　4.2 展望

　　本论文主要研究不同浓度的双乙酸钠对指状青霉菌丝体的生长是否有影响，并研究其对指状青霉菌丝体一些指标值的影响。但由于时间有限，并没有对指状青霉本身的一些特性做更多更细致的研究，是本研究的一大缺陷。而且，本人的能力有限，在论文中还存在很多不足之处，需要完善。

　　双乙酸钠是一种具有开发潜力的抑菌试剂，它可以有效的损伤指状青霉菌丝体细胞膜，并将完整的细胞膜结构破坏，增加细胞膜的通透性，导致指状青霉细胞内容物如钾离子、钠离子等金属离子大量泄露，还可以增加细胞成分如核酸等成分的释放，可以使细胞膜上重要成分脂质逐渐流失，破坏细胞的生存环境，从而导致指状青霉的菌丝体逐渐走向衰亡。

　　但实验数据显示，双乙酸钠对指状青霉菌丝体细胞胞外pH的影响并不理想，下一步可以考虑研究双乙酸钠结合其他试剂是否会产生协同效应，对指状青霉有更好的抑制作用。